背景・目的

これまで、遺伝子組換え植物を作出するための遺伝子導入法は種々開発されているが、それらを適用できる植物種には制限があり、また培養系が確立している植物種にのみ利用できるという制約があった。このような限界や組織培養の必要性を回避するための新たな手段として、遺伝子を導入した花粉を直接受粉して形質転換種子を作出する方法が提案されている。これは、植物の花粉が本来有している遺伝子の運び屋（ベクター）としての機能と、受精後の種子形成機能を利用するものである。 　本研究では、特許申請中の「遺伝子導入細胞の磁力選抜法」を用いて、磁力に反応する微粒子に遺伝子をコートし、それを花粉に導入後に磁力選抜を行う。この方法によって選抜した遺伝子導入花粉を直接受粉することによって、培養操作なしに、遺伝子組換え種子を作出する新技術を確立することを目的とする。

内容・方法

(1)磁性微粒子による花粉への遺伝子導入と磁力選抜 　従来、パーティクルガン（遺伝子銃）によって遺伝子を撃ち込むために使用される担体は、金やタングステンの微粒子（φ１μm）が一般的であった。しかし、これらの微粒子を用いて遺伝子を花粉に撃ち込んだときの導入効率は、10-4から10-5と極めて低率であるため、遺伝子導入花粉をストレスをかけずに選抜することは非常に困難であった。 　そこで本研究では、パーティクルガンの担体として鉄とニッケルの磁性微粒子を使用して、トウモロコシとカボチャの成熟花粉に遺伝子を撃ち込み後、処理花粉を磁石（ネオジム）に吸着させ、遺伝子が導入されている花粉の選抜を行い、選抜効率の改善を検討した。 (2)遺伝子導入花粉の直接受粉による形質転換体種子の作出 　磁力選抜の結果を基に、磁性微粒子に除草剤耐性遺伝子（bar）を付着し、パーティクルガンを用いてトウモロコシとカボチャの成熟花粉に撃ち込み、その花粉を磁石で選抜した後、トウモロコシの雌穂とカボチャの雌花に直接受粉した。それによって得た種子からの幼苗に、除草剤（ビアラフォス）溶液を散布し、生育傷害の見られない個体を予備選抜した。それらの葉からＤＮＡを抽出し、ＰＣＲとサザンブロット解析により除草剤耐性遺伝子の存在を確認した。

結果・成果

(1)磁性微粒子による花粉への遺伝子導入と磁力選抜 　ニッケルと鉄の微粒子を用いてマーカー遺伝子（ＧＦＰ）をトウモロコシ花粉に撃ち込み後、磁力選抜を行った結果、選抜前の25倍の高率で遺伝子導入花粉が回収でき、その効率は0.12％から3.0％まで向上させることができた。本研究の結果から、化学的ストレスに非常に敏感な花粉の選抜には抗生物質は使用できないので、物理的選抜のための磁性微粒子の利用価値は非常に高いものと考えられる。なお、本実験の磁気選抜において、遺伝子導入花粉を完全には回収できず、未回収のものもかなり多く残った。今後、磁気セルソーター（ＭＡＣＳ）を使用することが必要と考えている。 (2)遺伝子導入花粉の直接受粉による形質転換体種子の作出 　磁性微粒子に除草剤耐性遺伝子（bar）を付着し、パーティクルガンを用いてトウモロコシとカボチャの成熟花粉に撃ち込み後、磁石で選抜した花粉を直接受粉した。それから得た種子の幼苗に除草剤（ビアラフォス）溶液を散布し、生育傷害の見られない個体を予備選抜した。それらの葉からＤＮＡを抽出し、ＰＣＲおよびサザンブロット分析によって導入遺伝子の存在を確認した。その結果、形質転換体の作出効率はトウモロコシでは1.99％、カボチャでは2.32％であった。 　本研究において、遺伝子導入花粉の磁力選抜法と受粉法によって得られた種子のうち、約２％の確率で形質転換体が得られた。この確率は、花粉に遺伝子を導入したときの頻度に近い値であった。したがって、今後、形質転換体の作出効率を上げるためには、受粉前の遺伝子導入花粉の選抜方法を更に改良することが必要と考えられる。

今後の展望

本研究で成功した新しい形質転換体の作出法は、花粉の本質的な性質である遺伝子の運び屋としてのベクターの機能と、受精後の自然な繁殖過程を通した個体再生機能を利用したものである。したがって、この手法は培養操作を必要とせず、植物種の制限がなく使用できることが、最大の特色である。遺伝子導入花粉の受粉による形質転換種子の作出は、本研究が我が国で最初であり、世界で２例目である。この作出効率は、前例の結果に比べて1,000倍高いものであった。本研究では、遺伝子組換え種子の作出効率は約２パーセントであったが、今後、さらに形質転換種子の作出効率を向上させることによって、培養が困難であった植物種に広く適用されることを望んでいる。